白血病诊断综合分析的重要意义
来源：肿瘤防治研究２０１３年第４０卷第６期
摘要
目的证实白血病诊断综合分析的重要意义。
方法通过血常规、骨髓细胞形态学、细胞化学染色、流式细胞学白血病免疫分型、细胞遗传学分析、分子生物学检测及骨髓病理诊断联合检查，对6例白血病，包括急性早幼粒细胞性白血病M3a、大颗粒淋巴细胞性白血病、多毛细胞白血病(HCL)、急性粒细胞性白血病部分分化型M2a、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和急性髓系白血病微分化型M0进行诊断。
结果急性早幼粒细胞性白血病经骨髓细胞形态学、细胞化学染色后确诊;大颗粒淋巴细胞白血病经骨髓细胞形态学、细胞化学染色、流式细胞术检测后确诊;HCL经骨髓细胞形态学、细胞化学染色、流式细胞术和骨髓病理诊断确诊;急性粒细胞性白血病部分分化型经检查，骨髓细胞形态学、细胞化学染色和流式细胞术检查对该病例仍难以准确判断，最终行染色体核型分析和分子生物学检测帮助确诊。CLL经骨髓细胞形态学和流式细胞术确诊。急性髓系白血病微分化型经骨髓细胞形态学、细胞化学染色、流式细胞术检查和染色体核型分型综合确诊。
结论综合运用多种检验项目对确诊环境改变、老龄化等原因引起的不典型白血病具有重要的临床意义。
关键词白血病;细胞形态学;流式细胞学;细胞遗传学;分子生物学
科技高速发展带来生存环境的改变，引起人口结构的改变，疾病的种类、数量和表现也发生了改变。部分白血病患者的血象、骨髓象表现已经不再具有典型的白细胞总数升高、幼稚细胞分期明确的特征。本院近2年对白血病检查的结果显示57．1%的白血病都不是典型的白细胞增多性白血病，外周血白细胞计数常处于正常参考范围之内，甚至低于正常参考范围。幼稚细胞形态学分类面临着更大的挑战。面对这些越发复杂的问题，我们应该采取怎样的应对措施呢?我们通过对6例不典型白血病的诊断，证明联合应用检验项目对现代不典型白血病的确诊具有重要意义。
材料和方法一材料6例白医院～年初发病例。
1．急性早幼粒细胞性白血病M3a
患者，男，59岁。因发热2d伴二系细胞减少入院。入院查体:体温:38℃，精神可，肝脾不大。血常规:白细胞(WBC):1．60×/L;红细胞(ＲBC):4．44×/L;血红蛋白(Hb):g/L;血小板(PLT):41×/L。因外周血二系减少行骨髓细胞形态学、细胞化学染色检查。
2．大颗粒淋巴细胞性白血病
患者，男，85岁。因无明显诱因出现发热伴全血细胞减少2周入院。患者2周来出现发热，伴畏寒、寒战、盗汗、咳嗽、尿频、尿急、乏力，左腹部间歇性隐痛。外院查血常规示三系减少，脾肿大。入院查体:体温38．5℃，贫血貌，脾肋下3指，血常规:WBC3．82×/L;ＲBC2．10×/L;Hb70g/L;PLT8×/L。针对外周血三系减低，行骨髓细胞形态学、流式细胞白血病免疫分型等检查。
3．多毛细胞白血病(HCL)
患者，男，78岁。因全血细胞减少，慢性支气管炎急性发作入院。入院查体:体温36．5℃，精神可，面部皮肤可见多处散在紫红色斑片状，无瘙痒触痛。颈部见散在红色皮疹。B超示脾肿大。血常规:WBC3．19×/L;ＲBC3．79×/L;Hbg/L;PLT83×/L。针对外周血三系减低，行骨髓细胞形态学、流式细胞白血病免疫分型、骨髓活检等检查。
4．急性粒细胞性白血病部分分化型(M2a)
患者，女，67岁。因乏力20余天，头痛呕吐10d，疑脑出血入院。体查重度贫血貌，血常规:WBC．1×/L;ＲBC2．54×/L;Hb82g/L;PLT5×/L。血凝项目:纤维蛋白原1．80g/L，D-二聚体0．25μg/mL。行骨髓细胞形态学、细胞化学染色、流式细胞白血病免疫分型、细胞遗传学染色体核型分析及分子生物学融合基因等检查。
5．慢性淋巴细胞性白血病(CLL)
患者，男，70岁。CLL诊断1年，年6月复查血常规，提示异常细胞占40%。临床考虑慢淋急性变。行骨髓细胞形态学、流式细胞白血病免疫分型检查。
6．急性髓系白血病微分化型(M0)
患者，女，55岁。因无明显诱因高热2周入院，入院血常规:WBC1．83×/L;ＲBC2．39×/L;Hb73g/L;PLT7×/L。行骨髓细胞形态学、细胞化学染色、流式细胞白血病免疫分型、细胞遗传学染色体核型分析等检查。
二方法1．取材于髂后上棘抽取骨髓液先涂片5～8张，用于细胞形态学及细胞化学染色检查，再分别抽取1～2mL骨髓液于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管或肝素锂抗凝管，用于流式细胞白血病免疫分型、染色体检查和分子生物学融合基因检测;并取骨髓活检送病理检查。［1］
2．骨髓细胞形态学和细胞化学检查参考《全国临床检验操作规程第三版》［2］。
3．流式细胞白血病免疫分型根据不同白血病细胞表面表达分化抗原不同，经异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻青蛋白(APC)等标记的CD分子抗体孵育后，采用流式细胞术分析各CD分子表达的百分率［1］。所检查的CD分子包括胞膜抗原CD45、CD34、Gly-A、CD15、HLA-DＲ、CD14、CD13、CD64、CD33、CD61、CD41、CD11b、CD、CD19、CD7、CD2、CD5、CD10、CD20、CD38、CD22、TDT、FMC7、CD11c等;胞浆抗原MPO、CD79a和CD3。
4．染色体核型分析染色体制备采用不加任何刺激的骨髓48h短期培养法(PＲMI培养液，20%小牛血清)，常规收获后火焰滴片法，G显带。染色体核型描述依据《人类染色体方法学》［3］。
5．分子生物学融合基因检测取2～3mL骨髓血，与等量ＲPMI充分混匀，再行骨髓单个核细胞分离，再提取ＲNA，随后定量检测ＲNA浓度。
6．骨髓活检依据《骨髓活检病理学》［4］。
结果一急性早幼粒细胞性白血病外周血WBC1．60×/L;ＲBC4．44×/L;Hbg/L;PLT41×/L。血液分析仪SYSMEXXE-2无歧标提示，仅显示中性粒细胞比例降低，淋巴细胞比例升高。联系血液科后行骨髓穿刺，骨髓片内见异常早幼粒细胞明显增生占74．5%，柴捆样细胞多见。细胞化学染色过氧化物酶强阳性，糖元染色颗粒状阳性反应，氯化醋酸酯酶强阳性反应，特异性酯酶阳性且加氟化钠无抑制现象。骨髓细胞形态学诊断为急性早幼粒细胞性白血病M3a。
二大颗粒淋巴细胞性白血病1．骨髓象提示淋巴细胞增生活跃，多见圆型、椭圆型，染色质呈块状，含有数个或粗或细的嗜天青颗粒，胞浆丰富的淋巴细胞。过氧化物酶呈阴性，糖元染色呈颗粒状阳性反应。结合细胞化学染色，骨髓细胞形态考虑大颗粒性淋巴细胞性白血病，见图1。
2．白血病免疫分型
外周血CD3+:95%，而骨髓异常细胞占40%，髓系标志CD13、CD33、CD34均为阴性。主要表达淋系标志CD20、CD5、CD22、CD79a，弱表达CD19。由于仪器更换，未能获得流式图。
三多毛细胞白血病1．骨髓象提示淋巴细胞增生极度活跃，细胞形态考虑多毛细胞性白血病，见图2，但外周血毛细胞不明显。因试剂原因未能行酒石酸抑制试验。
2．流式细胞白血病免疫分型
外周血淋巴细胞占46%，其中T淋巴细胞CD7+:55．20%，CD2+CD5+:54．60%，CD3:55．35%，B淋巴细胞CD19:22．31%，CD22:24．80%，CD20:24．90%，FMC7+CD11c+:19．47%，CD11c:19．7%，FMC7:24．80%。可见外周血毛细胞特异性标志FMC7和CD11c表达弱阳性。建议行骨髓细胞流式细胞分型检查，但该患者不予配合，另行骨髓活检。
3．骨髓活检病理
院外送检，病理活检示CD20(+)，CD79a(+)，MPO(－)，LCA(+)，CD99(+)，CD5(－)。提示B细胞淋巴组织增生，考虑为多毛细胞白血病。
四急性粒细胞性白血病部分分化型1．骨髓细胞学检查提示原始粒与早幼粒细胞增生活跃。早幼粒细胞形态偏大，部分核呈圆型，部分核有凹陷，隐有核仁，胞浆淡兰，布满非特异性颗粒。过氧化物酶大部分强阳性，糖元染色弥散性阳性反应，特异性酯酶阳性反应。结合临床有脑出血现象，骨髓细胞形态学考虑急性早幼粒细胞性白血病M3a。见图3。
2．白血病免疫分型
粒细胞主要表达CD13、CD33、CD、CD15、CD11b、CD64，而CD34、HLA-DＲ均为阴性。见图4。
3．细胞遗传学染色体检查
骨髓染色体核型分析示46，XX，t(8;21)(q22;q22)［5］，提示为急性粒细胞性白血病部分分化型M2a。
4．分子生物学荧光定量聚合酶链反应(PCＲ)融合基因检测AML1-ETO融合基因阳性［6］。
五慢性淋巴细胞性白血病1．骨髓细胞学检查可见大量大而圆、核仁清晰可见，偶有空泡的淋巴细胞。形态学鉴别细胞幼稚还是成熟有一定困难。见图5。
2．流式细胞白血病免疫分型
淋巴细胞占96%，主要表达成熟B淋巴细胞CD19、CD5、CD20、CD22、CD79a。干祖期标志CD10、CD34均为阴性。见图6。
六急性髓系白血病微分化型1．骨髓细胞学检查可见一类异常细胞，形态大小不一，有的偏大，呈圆型、椭圆型，不规则型，有瘤状突起，胞核多核、双核多见，染色质疏松，核仁大而明显，胞浆颜色偏兰、量多，胞浆内可见少量嗜天青颗粒及空泡。过氧化物酶染色阴性，糖原染色块状强阳性反应，氯化醋酸酯酶染色阴性，非特异性酯酶染色阳性反应，加氟化钠抑制试验染色部分被抑制，酸性磷酸酶染色阳性反应。骨髓细胞形态考虑急性髓系白血病微分化型M0。见图7。
2．流式细胞白血病免疫分型
幼稚细胞增多占53．9%。主要表达髓系标志:CD13、CD33、CD11b、CD34，低表达CD38、CD7、CD，弱表达GLY-A、CD61、CD41，不表达CD3、CD19、CD79a。见图8。
3．细胞遗传学染色体检查
骨髓细胞难培养，仅见4组染色体核型，为4倍体，每组缺失2条5号染色体，无特异性。
三讨论白血病是造血干细胞异常克隆性疾病，具有高度异质性，传统的FAB形态学分型仅使70%左右的白血病得以分型。近年来，随着免疫学，细胞遗传学及分子生物学的发展，MICM(形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学)分型的应用，提高了对白血病的诊断，加深了对其本质的认识，在白血病疗效观察和预后判断方面也具有重要的临床意义。
典型白血病由于其特殊的形态学特点，往往可以依靠细胞形态学直接诊断。但不典型白血病因起病特殊，临床症状复杂，要即时诊断并非易事，故漏诊误诊时有发生［7］。国内报道白血病的误诊率为20%～36%［8］。在这种情况下，细胞形态学、流式细胞免疫分型、细胞遗传学、分子生物学融合基因再加病理活检的联合检查对于白血病的正确诊断就有极其重大的意义。
本研究中第一例患者不同于常见的急性早幼粒细胞性白血病，白细胞不是升高而是降低。血液分析仪仅显示白细胞及血小板降低，血液分析仪分类未见歧标且外周血涂片未见明显的异常细胞。另外临床表现也不典型，无发热出血现象。这种情况下极易造成急性白血病的漏诊。此时应积极与临床联系沟通及时行骨髓穿刺减少此类漏诊的发生。
本研究中第二例患者大颗粒性淋巴细胞形态学上极易误诊为粒细胞，此时联合流式细胞白血病免疫分型，髓系标志表达均为阴性，帮助排除了髓系白血病的可能。第五例患者慢性淋巴细胞性白血病治疗一年后，细胞形态发生变化。外周血及骨髓涂片中淋巴细胞均可见大而清晰的核仁，胞核染色质细密，极易误认为原始幼稚细胞，此时免疫分型检查可清楚的鉴别这类细胞是成熟细胞还是原始幼稚细胞，帮助排除了慢淋急变的可能。可见免疫分型能较精确地识别表达不同分化抗原的细胞，明确划分出细胞的发育阶段和类型，对于区分T或B淋巴细胞性白血病及形态学难以辨认的细胞，特别是在急性粒细胞性白血病与急性淋巴细胞性白血病的鉴别、急性淋巴细胞性白血病亚型区分及APL、M0、M6、M7等的诊断中尤为重要。
虽然免疫分型的引入，使白血病的诊断更趋细致，与临床治疗、预后估计的关系更趋密切，但由于在白血病的早期阶段，虽已发生了部分细胞增殖异常，但白血病细胞表面抗原的表达与正常细胞有交叉时，免疫分型则有一定的局限性［9］。本研究中第三例多毛细胞性白血病免疫分型中诊断多毛细胞的2个特异性抗原FMC7、CD11c表达均为弱阳性，而B淋巴细胞特异性抗原也表达为弱阳性，无法帮助确诊。此时结合病理活检的结果，肯定了异常细胞为B淋巴细胞，支持形态学诊断多毛细胞性白血病。最终该患者确诊为多毛细胞性白血病，并给予及时治疗。本研究中第四例病例M2a由于其形态学的不典型性，以及幼稚细胞发育相对成熟，造血干细胞标志CD34及HLA-DＲ表达均为阴性而造成误诊为M3a。所幸急性粒细胞性白血病M2型的染色体特殊易位t(8;21)及特异性融合基因AML1-ETO阳性帮助纠正了错误的诊断。由此可见染色体检查和融合基因检查对于白血病的诊断有决定性意义。另外染色体检查和基因检测更揭示了许多诊断和预后价值，是白血病诊断、预后、疗效观察的重要指标。
然而并不是所有的白血病均会有染色体核型的特异性改变［10］，当无特异性的遗传学改变时，综合分析其它的检查结果，采用排除法，相信可以得出较为准确的诊断。本研究中第六例患者，结合入院病史和血常规结果，临床高度怀疑恶性组织病。行骨髓穿刺术后，可见骨髓细胞形态发育异常，类似有巨幼样改变，与常见的各型原始幼稚细胞不同，较难从形态学上直接辨认。结合流式细胞学检查，高表达CD34，低表达CD38、CD7、CD，弱表达GLY-A、CD61、CD41，不表达CD3、CD19、CD79a。可判断此类细胞为原始细胞，且排除淋系的可能性。染色体检测未见特异性的改变。结合形态学、流式细胞术及染色体分析的结果，最终诊断为M0。
综上所述，通过外周血常规的提示，即时应用MICM分型原则，再结合病理活检，可帮助更精确地了解异常细胞的不同分化阶段和类型，对于提高白血病的诊断准确性、判断预后，有极大的临床意义。
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