胞内抗原根据物理位置可以分为：

胞浆内

细胞器内

细胞器表面

核膜上

核内

实验中检测的几种胞内标记物：

胞浆CD3（cytCD3）识别T淋巴细胞系细胞，抗髓过氧化物酶（MPO）识别髓系细胞，胞浆CD79a（cytCD79a）识别B淋巴细胞系细胞2

Bcl-2是一种调节细胞凋亡的细胞内（线粒体）蛋白，这种蛋白的过度表达导致对细胞死亡的抵抗，通常见于肿瘤细胞。抗Bcl-2常用于细胞凋亡、B细胞恶性肿瘤、化疗和滤泡t（14；18）染色体易位的研究3

ZAP-70是Syk蛋白酪氨酸激酶家族中的一种蛋白激酶，在T细胞信号转导和胸腺细胞发育中起重要作用。ZAP-70通常在T细胞和自然杀伤细胞（NK）中表达，在某些慢性淋巴细胞白血病（CLL）中也有表达4

TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）是一种存在于细胞核内的60kda聚合酶，对单链DNA中核苷酸的模板非依赖性加成进行催化。据报道，在正常的T细胞和B细胞发育过程中，这种分子参与了DNA和基因重排的调节或易位。它存在于正常胸腺和骨髓中的未成熟T和B淋巴细胞的细胞核中。急性淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病的某些肿瘤细胞具有高的TdT活性5

Ki-67是一种核内细胞增殖相关抗原，在细胞周期的各个活跃阶段均有表达。其表达可用于研究细胞增殖

胞浆免疫球蛋白表达（cytIgκ、cytIgλ和cytIgM）出现在B淋巴细胞以及多种癌细胞、上皮细胞和神经元中6

胞内抗原检测效果取决于：

充分地破膜通透以使得抗体能够进入并和目标抗原结合

并能保持细胞的完整性

保留抗原表位和抗体的结合能力

破膜固定剂根据用途分类如：

胞内磷酸化检测的

胞内细胞因子检测的

核内foxP3检测的

更普适的如BDCytofix/Cytoperm?,BDFACSlysingsolution(FL),BDFACSpermeabilizingsolution2(FP2)和FixPerm?CellPermeabilizationReagents(Invitrogen)

几种裂红、固定和破膜试剂举例：

BDIntraSure?Kit

BDFACS?lysingsolution(FL)(2hrFL)

BDFACS?permeabilizingsolution2(FP2)

FixPerm?CellPermeabilizationReagents(Invitrogen)(InvFP)GAS-

BDCytofix?fixationbuffer

处理过程：

结果比较：

散射光信号的变化

淋巴、单核和中性粒细胞的区分

白细胞的保留

胞内抗原的检测效果（胞浆CD3,MPO,CD79a;Bcl-2和ZAP-70;TdT;Ki-67;cytIgκ和cytIgλ;cytIgM）

图1.CD45vsSSC图上显示批量裂红WB

图2.CD45+白细胞数

图3.淋巴、单核和中性粒的比例

图4.胞内CD79a,MPO,和CD3染色结果

图5.胞内Bcl-2和ZAP-70，表面CD38染色结果

图6.胞内TdT染色结果

图7.胞内Ki-67染色结果

图8.胞内cytIgκ和cytIgλ染色结果

图9.胞内CytIgM染色结果

结果汇总表

讨论：

散射光特性:4种处理后CD45/SSC上能够显示三种主要白细胞群（淋巴、单核和粒细胞），尽管需要单独调整SSC参数以实现良好的群体分离（图1）。当使用相同的SSC设置时，InvFP处理的样品显示出较低的SSC特性（图4-9）。

回收率:用绝对计数微球测定4种处理方法后CD45+白细胞的保留情况。图2中的数据显示了类似回收率。淋巴、单核或粒细胞门中CD45+事件的相对百分比的比较显示所有六个供体的一致性（图3）。

胞内标记物结果比较:图4-9显示了4种处理后点图外观的代表性数据。数据的采集条件一致。同一个供者的样本进行比较。

2hrFLvs10minFL+FP2:2hrFL处理适合于同时检测胞内CD3、CD79a和MPO、cytIgκ和cytIgλ，10minFL+FP2处理适合于同时检测胞内Bcl-2和ZAP-70，以及TdT、Ki-67和cytIgM。

胞内CD3、MPO和CD79a、cytIgκ和cytIgλ在批量裂红WB中的表达:如图4和8所示，胞内CD79a、CD3和MPO以及表达cytIgκ和cytIgλ的群体在使用2hrFL、InvFP或BDIntraSure固定、破膜处理后可清楚地区分，百分比结果也类似。

胞内Bcl-2、ZAP-70和cytIgM在批量裂红WB中的表达:如图5和图9所示，胞内Bcl-2、ZAP-70和cytIgM的检测存在一些差异，这取决于所使用的固定和通透性程序（10minFL+FP2、InvFP或BD-IntraSure三种处理过程：胞内Bcl-2+和ZAP-70+，10minFL+FP2和BD-IntraSure处理分群清楚且百分比相似，InvFP处理细胞时未检测到Bcl-2（与FMO对照相比，只有在仔细选通后才能区分胞内ZAP-70+事件，与10minFL+FP2或BD-IntraSure相比，百分率较低，但仍在95%CI范围内）;CytIgM+事件，10minFL+FP2处理时，分群清楚，而用InvFP或BD-IntraSure处理时，需要仔细参考FMO对照（用InvFP处理时，细胞百分比变化极大，用BD-IntraSure处理时，细胞百分比减少）。

胞内TdT和Ki-67在批量裂红WB+REH中的表达:如图6和图7所示，10minFL+FP2、InvFP或BD-IntraSure三种处理过程TdT+和Ki-67+事件10minFL+FP2分群最好，InvFP或BD-IntraSure阳性门的界定需仔细点，百分比相似。

结论：

4种处理在散射光，淋巴、单核和粒细胞群的区分以及白细胞保留方面都非常相似。

每种方法适用于不同的胞内抗原检测。InvFP和BD-IntraSure简化了处理流程。

2hrFL处理适合于同时检测胞内CD3、CD79a和MPO、cytIgκ和cytIgλ，10minFL+FP2处理适合于同时检测细胞内Bcl-2和ZAP-70，以及TdT、Ki-67和cytIgM。

InvFP适用于11种被测胞内抗原中的9种。InvFP不适合检测细胞内Bcl-2，对ZAP-70的检测不理想。

BD-IntraSure可用于检测11种细胞内抗原中的10种，而不是检测cytIgM的最佳方法。

Reference：

转载请注明：http://www.jvwih.com/fyyf/13790.html