改造T细胞癌症免疫治疗的成就和挑战
在抗肿瘤的自身免疫反应失效的情况下，现代遗传实验技术提供了过继转移改造T细胞的方法来帮助我们对抗癌症。基因改造过的T细胞，所谓的“活体药物”，代表了一类新的抗癌症疗法。近期，在临床试验中，表达CAR(ChimericAntigenReceptors)和TCR(TCellReceptors)的改造T细胞在癌症治疗中取得了惊人的成果。来自美国宾夕法尼亚大学Perelman医学院的AndrewD.Fesnak,CarlH.June和BruceL.Levine在NATUREREVIEWSCANCER杂志上发表的综述中，提供了改造T细胞疗法的最新和最具前景的科研进展，并展望了下一代CART治疗的发展方向。
CART在癌症免疫治疗中的成就和挑战
CART最先应用于治疗恶性B细胞肿瘤，原因在于恶性B细胞肿瘤只表达几种保守的细胞表面标记，且B细胞肿瘤的循环性更能促进改造T细胞发挥作用。CD19是最常用的改造T细胞的作用靶标。CART19在治疗B细胞急性淋巴细胞白血病B-ALL(Bcellacutelymphoblasticleukaemia)，顽固性淋巴瘤和多发性骨髓瘤的干细胞疾病中有效果。然而，由于CART19细胞在肿瘤细胞中会发生表达下调和变异，所以需要寻找其他肿瘤细胞标记作为CART靶标。CD20和CD22广泛表达于B细胞急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。在同时表达双协同刺激因子的情况下，CART20能持续在惰性B细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤病人体内产生。CART22具有与CART20相似的抗肿瘤效果，但现在仍在I期临床试验阶段。同时使用不同CART来针对两个不同的癌症标记，具有阻止肿瘤细胞的免疫逃逸，克服单一CART疗法疾病复发的特点。以Ig轻链为靶标的CART能够保证B细胞和血浆细胞不受影响，但是能够引起细胞毒性，因此仍在I期临床试验阶段。以恶性B细胞为目标设计的改造T细胞证明了体外改造的T细胞能够消灭人类的肿瘤。但是，病人个体间的差异导致没有统一的标准来制备改造T细胞。而且，改造T细胞治疗后引起的免疫激活和细胞因子释放综合征CRS(Cytokinereleasesyndrome)等副反应需要谨慎的临床管理，如抗细胞因子治疗和调节T细胞活性。因此需要考虑不同的淋巴瘤组织学，不同的反应率和特殊的疾病因子来增强治疗效果。
对应于B细胞恶性肿瘤，非B细胞血浆细胞恶性肿瘤的几种靶标CART正处于研究阶段。成熟B细胞抗原BCMA(BCellMaturationAntigen)在大多数情况下表达于多发性骨髓瘤细胞，不在非血浆细胞中表达。BCMA-CART已经被证明在异种移植模型中能够消灭多发性骨髓瘤细胞，但仍处于I期临床试验阶段。睾丸癌抗原，NY-ESO-1，也被发现在血浆癌细胞中高表达，具有与NY-ESO-1高亲和性的TCR被整合到T细胞中，来治疗多发性骨髓癌。骨髓恶性肿瘤表达的CD33和CD可作为CART疗法的靶标，由于CD33和CD也可在正常造血干细胞上表达，所以，仍处在I期临床试验阶段。ROR1同时表达于胚胎组织和异常地表达于慢性淋巴细胞白血病CLL，套细胞淋巴瘤，B-ALL和其他很多实体肿瘤。临床试验表明，ROR1-CART能毒杀B细胞恶性肿瘤和肉瘤，且未发现明显的对正常组织的毒害作用，但针对CLL的临床试验仍处于I期阶段。
以实体肿瘤为目标的CART，虽然能够被运输到几乎人体的每个位点，而且能克服肿瘤免疫逃逸，但仍存在问题：大部分实体肿瘤不具有特异型，潜在肿瘤靶标标记在健康组织中也有表达，由此增加了治疗的副作用。一些特异性高的靶标，却不在肿瘤的所有细胞中表达。因此目前应用的实体肿瘤靶标多为在肿瘤组织中超表达的和相对无特异性的。例如，EGFRvIII几乎完全仅表达于恶性组织，且其表达存在于30%的恶性胶质瘤病例中。IL13Ra2在很多恶性胶质瘤病例中存在。EGFRvIII-CART在临床试验中被证实能够控制EGFRvIII阳性恶性胶质瘤的增长。已进行了第I阶段和I/II阶段的临床试验。IL13Rα2-CART也被证明安全。GD2在神经外胚层肿瘤，肉瘤，脑癌和小细胞肺癌中有较高表达量，同时在一些健康组织中有表达。在临床前模型中和对GD2阳性的神经母细胞瘤病人的Ⅰ期临床试验中，GD2-CART能引起抗肿瘤免疫反应，且未发现剂量限制的毒副作用。间皮质Mesothelin在很多实体肿瘤中高表达。在临床前试验中，Mesothelin-CART能够清除人类胸腔内外的间皮瘤损伤。HER2在多种实体肿瘤中超表达。HER2-CART具有致命的肺部毒性副反应。尽管如此，HER2-CART在治疗HER2阳性肉瘤中能够引起抗肿瘤免疫反应，且在清除髓母细胞瘤和恶性胶质瘤的临床前研究中被证明有效。也可使用CMV特异性异型T细胞，产生双特异性产物，即T细胞具有的TCR能识别CMV靶细胞，T细胞的CAR能识别HER2阳性细胞。并且，临床前期实验已表明双向CART细胞的安全性和适当的临床反应。对TCRs或是CARs新靶标抗原的选择最重要的是其具有肿瘤特异性。与受损多肽加工过程相关的T细胞抗原表位TEIPP（Tcellepitopesassociatedwithimpairedpeptideprocessing）抗原是T细胞特有的抗原表位，因此可以作为改造T细胞免疫疗法的靶标。
同时，与癌症进展及治疗抗性相关的癌症干细胞CSCs（Cancerstemcells)被发现在很多癌症中存在。在临床前实验和一例临床试验中，针对CSCs构建的CART细胞被证实能够消灭CSC细胞亚群。也可将T细胞改造后表达非特异性的分子的受体，然后将该非特异性分子与具有高肿瘤亲和性的中间媒介物相结合。或者，改造具有肿瘤抗原特异性的T细胞，使其在与肿瘤结合时分泌细胞因子（IL-12），由此刺激内源免疫细胞来消灭肿瘤。
CART在癌症免疫治疗中的未来
未来改造T细胞的基因转移和基因编辑技术必须考虑到治疗效果，安全性和成本几方面因素。基于病毒载体构建的细胞转导是T细胞转导中最常用的技术。慢病毒载体和反转录病毒载体能够将中等大小的负载基因结合到寄主体内。因为慢病毒能够降低插入致癌的风险性而优于反转录病毒载体。DNA转座子也能够有效地将基因插入到宿主基因组。SleepingBeauty转座子系统已经在改造T细胞的临床研究中得到应用，该系统的安全性和有效性目前处于调查阶段。然而，这些病毒和非病毒的基因整合方法都存在致癌隐患。电穿孔法是一项可用于基因改造和新肿瘤靶标测试的新策略。因其不需要基因整合，消除了插入致癌的风险。人类试验，RNA改造的Mesothelin-CART被证明是安全的。然而，由于mRNA是瞬时表达，因此需要反复多次过继转导细胞，这就可能产生与T细胞自身免疫源性相关的问题。大量mRNA改造的改造T细胞的临床试验已经被用来治疗恶性肿瘤。最后，使用ZFN（zincfingernucleases），TALENs(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases)和CRISPR–Cas9方法可将人类T细胞进行基因编辑，敲除抑制性受体或插入功能增强型分子。使用ZFNs方法敲除T细胞的CCR5(C-Cmotifchemokinereceptor5)基因，然后将改造的T细胞过继转移，这一方案被证明是安全的。CART细胞上CD25的敲除，使后续的CD52单克隆抗体的治疗不影响CD25阴性CART发挥作用。内部分子的编辑能够保证异型CART的安全性和有效性。
CART的运输和肿瘤的免疫抑制和免疫逃逸是影响CART治疗效率的重要因素。给药途径和药物能否有效运输到达肿瘤部位是T细胞发挥作用的重要因素。首先，临床前实体肿瘤模型试验表明，局部给药能够增强改造T细胞在肿瘤部位的积累，从而控制肿瘤的生长。其次，过继T细胞后较早与肿瘤接触，能够激活并提高T细胞介导的抗肿瘤反应。最后，由于趋化因子，趋化因子受体和配体的相互作用能够促进内部免疫细胞的运输，因此，表达趋化因子受体的改造T细胞运输到达肿瘤组织的能力增强了。肿瘤可以通过免疫逃逸和免疫抑制来躲过改造T细胞的作用。对于肿瘤的免疫逃逸，可以通过同时使用多种靶标CART来克服。对于肿瘤的免疫抑制，可以使用多种方法使改造T细胞内在性地具有肿瘤免疫抑制的抗性。如使改造T细胞表达TGFB(transforminggrowthfactor-β)receptortypeII，或表达IL-4外结构域和IL-7内结构域构成的嵌合受体。临床前实验表明，PD1抗体的加入能够增强CART的作用，同时，很多科研小组正在改造CART使其抗PD1-PDL1或是CTLA4-CD80/CD86。未来的T细胞免疫治疗方法将结合多种形式的免疫监测点阻断治疗方法来进一步加强CART的效率。
CART的安全性是免疫治疗中必须考虑的因素。尽管CART疗法的致死性率远低于用于治疗易复发和难治愈性疾病的传统疗法，但是CART疗法具有严重的副反应。因此提高CART治疗的安全性是必要的。分子“开关”能够影响改造T细胞在细胞内作用的发挥，也能够提高安全性。可以改造T细胞，使其能在胞外信号的诱导下，表达促进死亡信号，使T细胞发生自我毁灭。也可以改造T细胞，使其只有在胞外分子存在的条件下才被激活。将改造T细胞标记特异性细胞表面分子，该细胞表面分子能与单克隆抗体作用。如果该特异性细胞表面分子也在肿瘤细胞中表达，那么相应的单克隆抗体就能够消除CART细胞产生的副作用，同时杀死肿瘤细胞。但是该CART设计仍需要更多的临床试验来测试。也可通过加强CART细胞的特异性来消除脱靶产生的副反应。例如使CAR细胞外部分包含两个相连的具有特异性的scFvs。这样目标细胞只有同时表达两种靶标时，才能引起T细胞激活。或者，改造T细胞使其表达两个能与不同配体结合的不同CARs，其中一个CAR包括CD3ζ结构域，另一个CAR包含协同刺激因子结构域。最后，也可以将细胞外scFv与抑制信号结构域结合，以此来抑制CART细胞的激活。这样抑制信号就能够保护具有特异性免疫表型的细胞。
Figure2
Newchimericantigenreceptormodelsandconcepts
小结
与免疫监测点阻断疗法和激酶靶标药物相比，CART细胞过继转移疗法的副作用和花费相对较小，因此具有很好的应用前景。首先，改造T细胞只需要一次治疗，却具有持久性疗效。其次，几乎所有急性淋巴细胞白血病的患者都对CART有反应。将CART疗法和多种其他疗法综合使用，也许会使患者有较长存活时间，并且可能使几种癌症最终得到治愈。未来细胞改造技术的发展和更广泛异型T细胞的获得将为CART免疫治疗的发展提供支持。
原始出处：EngineeredTcells:thepromiseandchallengesofcancerimmunotherapy.（）
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