雷公藤红素单用和联用抗肿瘤作用机制的研究
摘要：雷公藤红素是雷公藤中的主要活性成分之一，现代研究表明，雷公藤红素具有广谱、高效的抗肿瘤活性，其抗肿瘤作用机制包括抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞自噬等作用，同时雷公藤红素联合用药还具有协同增敏、逆转肿瘤多药耐药的作用。综述了近几年雷公藤红素单用及联合用药抗肿瘤的作用机制，此外还总结了目前用于雷公藤红素药物递送系统，并对未来研究方向加以讨论，旨在探明雷公藤红素作用机制，通过联合用药以及改变递药系统提高雷公藤红素抗肿瘤效果，为今后雷公藤红素的研究与应用提供参考，以促进雷公藤红素的研究和临床应用。
近年来，全球肿瘤发病率和死亡率正在迅速增长，恶性肿瘤严重危害了人们的健康，影响了人们的正常生活[1]。化疗是目前肿瘤治疗的主要方式，但大多数化疗药物水溶性较差、生物利用度不高且化疗药物对正常细胞的非选择性作用，大多数常规化疗患者出现严重的不良反应[2]。中药活性成分具有高效、低毒、作用广和靶点多等优势，可有效克服或弥补化疗药物严重的不良反应和肿瘤耐药性[3]，这使得中药活性成分逐渐成为研究热点，通过研究中药活性成分以获得更好的肿瘤治疗。
雷公藤红素又名南蛇藤素，是从卫矛科植物雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.中提取的五环三萜类单体化合物，除了具有抗炎、抗风湿、止痛、治疗神经性退化疾病等多种药理活性，还具有显著的抗肿瘤活性，对前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、胶质瘤、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌等细胞均有抑制作用[4-8]。现代研究表明，雷公藤红素具有广谱、高效的抗肿瘤活性，与传统抗肿瘤药物相比，自身细胞毒性作用轻，抗肿瘤活性更强，并能表现出明显的放疗及化疗增敏作用[9]。随着近年来雷公藤红素研究的深入，其广泛的应用和独特的优势使其有望成为抗肿瘤的有效药物。本文综述了近几年雷公藤红素单用及联用抗肿瘤作用机制及其递药系统的研究进展，以期为今后雷公藤红素的深入研究和广泛应用奠定基础。
1抗肿瘤作用机制
1.1抑制肿瘤细胞增殖
肿瘤细胞具有无限增殖的特性，雷公藤红素可以通过促进肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞自噬、阻滞细胞周期等抑制肿瘤细胞增殖，从而达到治疗肿瘤的作用。
1.1.1诱导肿瘤细胞凋亡细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞程序性死亡，通过一系列基因的激活、表达以及调控等作用，其异常功能是肿瘤生长和抗肿瘤发展的基础。由雷公藤红素介导的细胞凋亡主要通过3种通路实现：线粒体参与的内源性信号通路、外源性信号通路和内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS）介导的细胞凋亡。
线粒体参与的内源性信号途径主要是由关键调节因子B淋巴细胞瘤-2（B-celllymphoma2，Bcl-2）家族蛋白导致的线粒体膜的破坏或通透，从而导致细胞色素c（cytochromec，Cyt-c）的释放和其他凋亡因子的表达。在细胞质中，Cyt-c与三磷酸腺苷形成一种称为凋亡酶激活因子的复合物，该复合物激活半胱氨酸天门冬氨酸特异的蛋白酶9（cysteinylaspartatespecificproteinase-9，Caspase-9）进而激活下游Caspase-3等相关靶点[10]。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bcl-xL和Survivin）和凋亡前Bcl-2家族蛋白[B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子（Bcl-2asociateddeathpromoter，Bad）、Bcl相关X蛋白（Bcl-associatedXprotein，Bax）、BH3结构域凋亡诱导蛋白（BH3interactingdomaindeathagonist，Bid）和Bcl-2细胞死亡调节因子（Bcl-2interactingmediatorofcelldeath，Bim）]，他们通过调节Cyt-c的释放来抑制或促进细胞凋亡[11-13]。Yang等[14]在研究雷公藤红素对人乳腺癌MCF-7细胞的作用机制时发现，雷公藤红素通过降低Bcl-2表达，增加Bax表达来诱导Cyt-c和凋亡诱导因子释放从而使得Caspase-7、8、9活化，诱导聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（polyADP-ribosepolymerase，PARP）裂解以及Caspase-8介导的Bid裂解。雷公藤红素还可以通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（proteinkinaseB，PKB/Akt）途径诱导细胞凋亡[15]。当用雷公藤红素5μmol/L和拉帕替尼5μmol/L组合处理人乳腺癌MDA-MB-细胞时，可以在体外生长抑制和凋亡方面显示出强大的协同作用，表明凋亡相关蛋白（Caspase-9、3）与生长途径相关蛋白[人类表皮生长因子受体2（humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，HER2）、磷酸化HER2（p-HER2）、磷酸化Akt（p-Akt）和磷酸化细胞外调节蛋白激酶（phosphorylatedextracellularregulatedproteinkinases1/2，p-ERK1/2）]的下调[15]。雷公藤红素处理后的细胞线粒体通透性发生改变，使得线粒体膜电位破坏[16]。另外有研究发现雷公藤红素可以通过抑制肽基脯氨酰顺/反异构酶（peptidyl-prolylcis-transisomeraseNIMA-interacting1，Pin1）表达，从而抑制Akt、信号转导与转录激活因子3（signaltransducerandactivatoroftranscription3，STAT3）、p38、c-Jun氨基端激酶（c-Junamino-terminalkinases，JNK）、p65和白细胞介素（interleukin，IL）-6表达[17]。Zhang等[18]研究表明雷公藤红素2、4μmol/L处理2d后，人卵巢癌OVCAR3细胞中miRNA-21的相对表达水平降低，miRNA-21表达的下调会导致细胞OVCAR3中PI3K/Akt-核转录因子（nucleartranscriptionfactor-κB，NF-κB）的表达水平降低，从而通过线粒体途径诱导细胞凋亡。
死亡受体介导的外源性信号通路是通过促凋亡配体与促凋亡受体结合导致死亡诱导信号复合体的形成[19]，如自杀相关因子（factorassociatedsuicide，Fas）、肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）-αR、DR3、DR4和DR5等死亡受体通过激活配体诱导细胞凋亡。雷公藤红素通过增加TNF受体（TNFreceptor，TNFR）-1、TNFR-2、Fas、DCR2、DR5、RIP和TNFR相关死亡结构域蛋白的表达来诱导口腔癌SASV16细胞凋亡[20]。NF-κB途径是细胞因子刺激、细胞周期、凋亡和血管生成的关键调节因子[21]。Ni等[22]在使用雷公藤红素处理骨髓瘤细胞后，采用免疫印迹法对NF-κB信号通路进行了检测，NF-κB和IκB激酶α（IκBkinaseα，IKKα）的表达降低，用免疫荧光法检测雷公藤红素处理后NF-κBp65亚基的核转位，结果表明雷公藤红素以时间相关的方式有效地阻止了p65亚基的核转位和NF-κB抑制蛋白α（inhibitorofNF-κBα，IκBα））裂解。此外，Mou等[23]发现雷公藤红素作用人肺癌A细胞48h后激活自杀相关因子配体与Fas结合，并通过激活Caspase-8触发外部途径细胞凋亡。雷公藤红素可以减弱豆蔻酰佛波醇乙酯、TNF-α对IL-6基因表达的激活作用，下调IKKα、p50和p65的表达，通过NF-κB依赖途径下调IL-6基因表达，达到抑制前列腺癌细胞增殖的目的[24]。TNF相关凋亡诱导配体（TNFrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL）是TNF超家族成员之一，其与DR4/DR5结合可诱导细胞凋亡。在研究雷公藤红素诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验中，Li等[25]发现雷公藤红素可以上调外源性凋亡途径蛋白DR5的表达。
ERS是细胞的一种保护机制，但是当长时间过度应激或功能障碍时，可能会诱导凋亡。ERS通常伴随着能诱导ERS活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）生成的增加，过多的ROS水平干扰氧化还原动态平衡从而诱导细胞凋亡[26-27]。同时，ERS也会导致线粒体功能障碍，增加线粒体ROS生成[28]。研究表明，雷公藤红素可以诱导JNK的激活进一步的诱导C/EBP同源蛋白（C/EBPhomologousprotein，CHOP），从而诱导DR5死亡受体的表达，最终引起细胞凋亡[29]。在用雷公藤红素1μmol/L处理MCF-7细胞后，发现雷公藤红素可以通过ROS-蛋白激酶C-AMP活化蛋白激酶-p53蛋白-Polo激酶1通路诱导细胞凋亡[30]。同样，Chen等[27]发现雷公藤红素诱导ROS积聚激活JNK，进而启动线粒体介导的细胞凋亡。雷公藤红素通过ROS积聚诱导HSP90客户蛋白表达下调，并通过抑制线粒体呼吸链复合体I活性促进ROS积聚。雷公藤红素诱导产生的ROS可以激活多种信号通路，如包括p38、JNK和ERK1/2在内的丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedproteinkinase，MAPK）家族成员进而诱发细胞凋亡[31]。研究表明，雷公藤红素3μmol/L处理人骨肉瘤HOS细胞24h可诱导发生凋亡，该作用是通过上调ERS相关蛋白[兔抗人结合免疫球蛋白（bindingimmunoglobulinprotein，BiP）、p-蛋白激酶样内质网激酶、肌醇依赖酶1α、钙联蛋白和蛋白质二硫键异构酶]、凋亡相关蛋白（CHOP、Caspase-12）和Caspase-3的表达等[32]。Yoon等[33]发现雷公藤红素通过诱导细胞凋亡来杀死乳腺和结肠癌细胞系，这种细胞死亡模式的特征是通过扩张内质网和线粒体而出现广泛的空泡化。雷公藤红素诱导活化转录因子4（activatingtranscriptionfactor4，ATF4）、CHOP、赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸受体的积累，同时通过线粒体钙离子单向转运体介导的线粒体Ca2+摄取、三磷酸肌醇受体介导的内质网Ca2+释放诱导内质网应激。雷公藤红素通过诱导线粒体功能障碍从而增加ROS生成，破坏线粒体膜，促进Cyt-c的释放，进而激活Caspase-3和Bax的表达，诱导人肝癌HepG2细胞凋亡[34]。雷公藤红素诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制见图1。
1.1.2阻滞细胞周期细胞周期的调控由细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependentkinases，CDKs）、CDKs抑制剂三者共同协调完成[35]。研究表明，雷公藤红素通过下调miR-21的表达明显抑制细胞增殖，并抑制细胞增殖相关蛋白CyclinD1和CDK6的表达，诱导G2/M细胞周期阻滞[36]。雷公藤红素上调G2/M期相关蛋白细胞周期检测点激酶2（checkpointkinase2，Chk2）、磷酸化Chk2（phosphorylateChk2，p-Chk2）、p-周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependentkinases1，Cdc2）和p-Cdc25C的表达，下调Cdc25C的表达，增加CyclinB1的表达。此外，雷公藤红素还增加了p21的蛋白质水平，阻断Cdk1/CyclinB1的激活[31]。Li等[17]分别用雷公藤红素0.25、0.5、1μmol/L处理人卵巢癌SKOV3细胞24h，当雷公藤红素剂量为1μmol/L时可以显著抑制CyclinD1、CDK2、CDK4和Bcl-2的下调以及Caspase-3的增加，从而显著抑制G2/M期细胞的活力并诱导凋亡和细胞周期停滞。另一项研究表明雷公藤红素通过上调p-Chk2、Chk2、p-Cdc25C、p-Cdc2、p21和CyclinB1的表达，并下调Cdc25C和Cdc2的表达，诱导G2/M期的细胞蓄积，并且G0/G1和S期相应减少[25]。CyclinE是一种核蛋白，与CDK2缔合，并在G1期晚期形成活性复合物，引导其进入S期。在雷公藤红素处理的人骨髓瘤RPMI-细胞中发现通过下调CyclinD1和CyclinE水平，上调p21和p27水平诱导细胞凋亡[37]。雷公藤红素阻滞肿瘤细胞周期的作用机制见图2。
1.2抑制肿瘤细胞转移
癌症患者的死亡通常是由于肿瘤细胞转移造成的。细胞黏附是肿瘤细胞转移级联过程中的关键步骤，阻断这一步骤被认为是预防和治疗肿瘤转移的合理策略。实体瘤的生长和转移依赖于新形成的邻近血管的血液供应。因此，肿瘤血管成为潜在治疗干预的关键靶点[38]。据研究报道，雷公藤红素抑制β-1整合素介导的活性从而抑制人脐静脉内皮HUVECs细胞与纤连蛋白的黏附。Ke等[38]用1.0、2.0、4.0、8.0μg/mL雷公藤红素作用于HUVECs细胞1h，细胞黏附率分别降至87%、68%、52%、46%。此外，有研究发现，用雷公藤红素处理人肺癌95-D细胞和小鼠黑色素瘤B16F10细胞，可以明显抑制该细胞外基质黏附。这种抑制是通过增强β-1整合素配体亲和力以及降低黏着斑激酶磷酸化实现的[39]。研究发现脂多糖通过激活细胞表面受体toll样受体4（toll-likereceptor4，TLR4）促进血管生成，雷公藤红素可以下调脂多糖诱导的人多发性骨髓瘤Lp-1细胞上TLR4的表达[40]。雷公藤红素还可以抑制血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）分泌以及Akt/一氧化氮合酶信号转导[41]。关于雷公藤红素抑制肿瘤细胞迁移的通路，有报道表明雷公藤红素诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡并抑制Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）/p70核糖体蛋白S6激酶（p70ribosomalproteinS6kinase，p70S6K）通路。研究者用VEGF50ng/mL和雷公藤红素0、0.5、1、2、5μmol/L共同处理PC-3细胞后，发现雷公藤红素以浓度相关地方式有效抑制VEGF触发的HUVECs细胞的mTOR信号级联反应，包括Akt、mTOR和S6K激酶的激活，提示雷公藤红素通过阻断mTOR信号通路抑制肿瘤血管生成[42]。基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）是癌症侵袭的重要组成部分，用雷公藤红素0、0.1、0.5、1μmol/L处理HepG2细胞后，通过免疫印迹法检测到雷公藤红素以剂量相关地方式显著降低MMP-2和MMP-9蛋白水平，进一步的研究发现抑制miR-的表达可以降低MMP-9的蛋白水平[43]。同样，Ma等[44]发现雷公藤红素通过抑制mTOR/p70S6K/真核生物翻译起始因子4E和ERK信号通路来抑制缺氧诱导的缺氧诱导因子1α的激活，从而抑制VEGF的表达。
1.3诱导肿瘤细胞自噬
自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，从而实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。p62在氧化应激反应途径中起着关键作用[45]。p62表达的增加也可能与ROS的产生有关。Liu等[31]发现雷公藤红素触发了自噬，并上调了程序性死亡受体-1和微管相关蛋白轻链3B（microtubule-associatedproteinlightchain3B，LC3B）的表达以及p62的水平，通过激活ROS/JNK信号通路和抑制Akt/mTOR信号通路，同时触发胶质瘤细胞凋亡和自噬。同样，在HOS细胞和人骨肉瘤MG-63细胞中，Li等[25]发现雷公藤红素诱导的LC3B-II表达的增加。雷公藤红素1.2μmol/L作用于人宫颈癌HeLa细胞12h，可观察到LC3点的形成和聚集，提示雷公藤红素可诱导自噬小体的形成。雷公藤红素处理的HeLa细胞12h内，上调自噬标志物LC-3Ⅰ转化为LC-3Ⅱ和LC3来诱导肿瘤细胞系[46]。此外，Guo等[47]发现雷公藤红素下调雄激素受体及其靶标miR-17-92a，从而导致前列腺癌细胞自噬。
1.4抑制炎症应激
炎症被认为是对病原体或受损细胞的生物反应。长时间的炎症应激会引起过敏症状和许多疾病的进展，包括肿瘤的生成。炎症的发生通常与NF-κB调节的细胞因子有关，如TNF-α和IL-1β，然后抑制TNF-α诱导的抗凋亡（如Bcl-2、Bcl-xL和Survivin）、侵袭（如MMP-9）和血管生成相关蛋白的基因表达来发挥抗肿瘤作用。雷公藤红素已显示出对炎症介导的肿瘤细胞的保护作用。研究发现，雷公藤红素可以通过调节Notch信号通路抑制肿瘤增殖，诱导人白血病U细胞凋亡[48]。在人脑星形胶质瘤细胞中，雷公藤红素下调黏附分子（如细胞间粘附分子-1/血管细胞粘附分子1）和趋化因子[如单核细胞趋化因子-1（monocytechemotacticprotein-1，CCL2）、CXC趋化因子8（C-X-Cmotifchemokineligand8，CXCL8）和CXCL10]的表达。研究者通过使用雷公藤红素处理人脑星形胶质瘤CRT-MG细胞发现雷公藤红素通过抑制JNK-MAPK-STAT1/NF-κB信号调节促炎介质的表达[49]。同样，另一项研究发现，雷公藤红素通过NF-κB调节的趋化因子（CCL2、CXCL10、CXCL12、CCR2和CXCR4）基因抑制人类风湿关节炎成纤维样滑膜RA-FLSS细胞的增殖和侵袭[50]。
2联合用药
2.1抗肿瘤作用机制
雷公藤红素作为目前具有抗肿瘤前景的中药活性成分之一，雷公藤红素的临床应用受到了严重的肝、肾毒性以及免疫抑制限制。迄今为止，对于许多类型的肿瘤，联合治疗被认为是临床上优选的治疗过程。药物联合使用产生的协同作用可以提高单独用药治疗功效，从而减少每种药物的剂量，为患者带来更好的耐受性，减轻药物毒副作用。此外由于不同药物的不同作用机制，单一用药经常会使肿瘤细胞产生耐药性，联合疗法降低了耐药性的风险。因此，雷公藤红素联合用药为肿瘤治疗提供了新的机遇。具体联合作用机制主要包括抗肿瘤多药耐药性（multidrugresistance，MDR）、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移、阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞自噬等。
2.1.1协同增敏，逆转肿瘤MDR肿瘤MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时，对于结构和作用机制不同的多种化疗药物表现出的交叉抵抗现象，是肿瘤难治疗、易复发的主要原因之一。研究表明，雷公藤红素联合其他药物增敏是解决肿瘤MDR的一种可靠方法。Lu等[51]发现TNF-α与醉茄素A2.5μmol/L或雷公藤红素0.5μmol/L联合作用时，以剂量相关地方式激活Caspase-3、9，下调X连锁凋亡抑制蛋白（X-linkedinhibitorofapoptosisprotein，XIAP），诱导人乳腺癌MDA-MB-细胞凋亡。这种结合还导致蛋白酶体靶蛋白IκBα的积累，从而抑制NF-κB信号的激活，从而使MDA-MB-细胞对醉茄素A和雷公藤红素增敏。有研究者探讨了雷公藤红素联合表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitor，EGFR-TKIs）对TM突变人肺癌H细胞生长的影响及可能的机制，结果发现联合用药抑制H细胞EGFR、STAT3、p-Akt和p-ERK的表达和磷酸化，提示通过抑制p-EGFR途径抑制H细胞的侵袭[52]。同时，体内实验也证明了雷公藤红素联合EGFR-TKIs对小鼠肿瘤生长具有更显著的抑制作用。Boridy等[53]通过雷公藤红素与替拉替尼联用，抑制了HSP90靶向蛋白毒性应激反应，可使人胶质母细胞瘤对雷公藤红素治疗增敏，增加多泛素化聚集体和p62积累，直接影响蛋白稳定，从而克服胶质母细胞瘤中的MDR。雷公藤红素除了与药物联用可以增加抗肿瘤效果以外，还可以通过增强肺癌细胞辐射敏感性来对抗肿瘤。Lee等[54]检测了雷公藤红素的放射增敏活性，结果表明EGFR、人表皮生长因子受体-2（humanepidermalgrowthfactorreceptor2，ErbB2）和Survivin水平降低，丝氨酸（serine，Ser）15和Ser20残基磷酸化同时抑制其蛋白酶体降解以及上调p53水平。
2.1.2诱导肿瘤细胞凋亡Yan等[15]对拉帕替尼5μmol/L与雷公藤红素5μmol/L联合诱导HER2/neu高表达的人乳腺癌MDAMB-细胞凋亡进行研究，发现两药联合可以通过上调凋亡相关蛋白（Caspase-9、3），下调生长途径相关蛋白（HER2、p-HER2、p-Akt和p-ERK1/2）以及降低HER2膜蛋白表达来增强细胞的凋亡和生长抑制。Zhu等[55]发现Bcl-2抑制剂ABT-μmol/L与雷公藤红素1.25μmol/L联合应用可协同抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。其作用的通路包括内质网应激介导的细胞凋亡和线粒体参与的内源性信号途径等。线粒体参与的内源性信号途径具体包括增强Caspase-3和PARP的裂解作用，诱导Bax积累，降低Bcl-2和Bcl-xL表达水平，同时上调Bim和重组p53，上调凋亡调节因子（re
