国庆特稿4基因组编辑让一切皆有可能
基因组编辑：让一切皆有可能
本文节选自中科院遗传与发育研究所焦雨铃研究员和汪颖研究员所著新书《聚焦基因》。
天书一般的DNA，只用了四个字母就完成了对生命的谱写。五六十年前，人们为终于能够开始阅读这本书而兴奋不已，到如今，虽然我们已经有能力将这本书的内容翻译出来，但也只能说读懂了这本书的一小部分。然而，人们的理想显然不止要读懂这本书，具有极大主观能动性的我们还想写一本书，一本自己需要的书。坏消息是我们暂时还没有这样的能力——其实这种能力究竟是好是坏还是个问题。好消息是我们已经可以开始编辑基因组，最近出现的新型研究工具几乎可以让科学家在基因组的任何地方实现对基因序列的精确改编。这项技术一出现，便被人们誉为获得诺贝尔奖的热门。接着各式各样与基因组编辑有关的学术论文扑面而来，在各个物种中，科学家展开了基因组编辑技术的研发，仿佛学术圈满天飞的都是“基因组编辑”这五个大字——从如此高涨的热情来看，人们对这一天的期待已经太久了。
令人记忆犹新的是20世纪80年代，科学家通过将小片段DNA添加到小鼠胚胎干细胞中构建和培育出第一个转基因动物，但此时转基因的插入是随机的不可控的；后来马里奥·卡佩奇（MarioCapecchi）、马丁·埃文斯（MartinEvans）和奥利弗·史密斯（OliverSmithies）借助同源重组的方法，利用细胞自身拥有的将自身DNA与外来DNA交换的能力，向小鼠胚胎干细胞中靶向插入基因，他们也因此获得了年的诺贝尔生理学或医学奖。这时候，人们为能够得到可遗传的转基因动物而兴奋。时移世易，几年后人们又不满足于同源重组过程在正常细胞中的自然发生频率而发明了新一代技术，这些技术可以促进同源重组效率，实时实地地对基因组序列进行修改编辑。
这些修改技术具体可以分为三种：锌指核酸酶（Zinc-FingerNuclease，ZFN）系统、转录激活样效应因子核酸酶（TranscriptionActivator-LikeeffectorNuclease，TALEN）系统和CRISPR/Cas9（ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats）系统。这三项技术都是制造双链断裂，并且在DNA修复断裂过程中引入修改。因此，要理解基因组编辑的要义，我们首先得了解DNA双链断裂的修复机制。DNA双链断裂后的修复主要有两种，一种叫做同源性修复（Homology-DirectedRepair，HDR），另一种叫做非同源末端相连（Non-HomologousEndJoining，NHEJ）。同源性修复是指DNA断裂点利用与之具有序列同源性的模板进行修复，通常这种修复会将断裂的DNA修复成和原来差不多的序列。非同源末端相连则可以发生在同时断裂的两段DNA之间，因此很可能造成比较大的DNA片段位移、倒转甚至丢失，易导致染色体的致命重组。细胞染色体经过能量较高的射线辐射之后，由于同时产生的双链断裂点比较多，所以倾向于通过非同源末端相连进行修复。在早期的果蝇研究中，科学家利用γ射线得到过一系列包含染色体缺失和（或）平衡染色体的果蝇，这些果蝇都只能以杂合体方式存活，但也成为果蝇遗传学和基因图位克隆中非常便利的工具。在细胞内这两种DNA双链断裂修复机制同时存在的情况下，基因组编辑利用哪一种？正因为上文我们已经指出的非同源末端相连有可能造成的致命后果，所以结论是显而易见的：同源修复是基因组编辑的不二之选。
那么问题来了，怎样保证同源修复发生，而另一种修复不发生？只制造必要的DNA双链断裂点是可以的，但这时如果以同源染色体作为模板进行同源修复，修复完又变成原来的模样，那不是“白白”断了一次吗？所以在基因编辑中，需要使DNA双链断裂修复不以另一条染色体为模板，而是以过量的外源特定序列为模板。这段特定序列与DNA断裂点侧翼序列需要有一定程度的序列同源性，才能保证染色体断裂点以外源DNA为模板进行的同源修复得以发生。那么第二个问题来了，怎样才能保证断裂发生在指定的位置上？断裂，可以用核酸酶来制造。可是一般的核酸酶仅仅依靠切割位点上下游的几个碱基来识别，有可能同时制造出许多断裂，那么要在指定的地点制造出有限的断裂，就需要核酸酶有非常稳定且可控的序列特异性。所以基因组编辑技术的发展主要是围绕着对核酸酶序列特异性控制的发展，而细胞自身的DNA修复机制就足以保证在断裂点引入特定突变。
最早出炉的是锌指核酸酶，它有两个结构域：锌指蛋白结构域和核酸内切酶结构域（图1）。核酸内切酶结构域不能识别序列；序列特异性取决于锌指蛋白结构域。锌指蛋白是转录因子，每个“指头”模块可以识别3~4个碱基序列，人们已经可以制造识别各种碱基组合的锌指蛋白结构模块；将这些模块混合搭配（每个锌指核酸酶拥有两个锌指蛋白模块），就可以靶向目的序列。因此，锌指核酸酶可以针对特定序列进行切割，制造双链断裂，并在DNA修复的过程中利用与锌指核酸酶同时引入的突变模板将突变引入DNA。但是锌指核酸酶系统有很明显的缺陷，就是实施过程长且成本高。因为针对每段序列，都需要设计一对锌指结构模块，并将其组装在一起，所以设计和制造该酶的过程比较漫长和烦琐。市场上已有商业化的锌指核酸酶定制平台，通常一个组合的售价在~美元。早期，锌指核酸酶是科学家不错的选择，但是科学家也期待更为灵活的系统出现。
图1锌指核酸酶系统识别并切割DNA双链示意图
TALEN就是这样一个相对灵活的系统，它跟锌指核酸酶的结构比较相似，也是由两组转录因子及核酸酶结构域组成，其中转录因子结构域包含33~35个氨基酸模块，每个模块可以识别靶定单个核苷酸（图2）。通过组装这些模块，科学家可以指向任何他们想要的序列。我们可以看出TALEN和锌指核酸酶的工作原理是极为相似的，锌指核酸酶提供了基因组编辑技术的理论基础，并且提供了可行性的验证，而TALEN则让基因组编辑技术变得更为容易、便宜、快速。然而即便如此，TALEN的成本也还是比较高，并且过程也相当长。
图2TALEN系统识别并切割DNA双链示意图
上述两种基因组编辑技术都是采取DNA序列识别部分和核酸酶部分分开的策略。人们在微生物中发现了一种大范围核酸酶（Meganucleases），这种酶可以识别18个核苷酸序列，由于需要同时匹配18个核苷酸，所以特异性极高。但同时自然界中存在的这种大范围核酸酶极为罕见，所以灵活度不高，应用范围较小。科学家依靠突变筛选将这种大范围核酸酶的DNA识别位点进行突变，以期获得更多种能够识别不同序列的大范围核酸酶。但是这种突变筛选的方法远远不能将69亿（）种可能性穷举。
以上这几种方法都不能让人满意，但是科学家为了能够编辑基因组，真是蛮拼的。年，一种被称为CRISPR/Cas9系统的新生力量出现了，它的原理和以上三项基因组编辑技术的原理完全不同，不依靠人造蛋白来提供序列特异性，而是依靠一种短链向导RNA。在这个系统中，核酸酶Cas9结合短链向导RNA，便可以切割与向导RNA特异结合的DNA序列从而形成DNA双链断裂点（图3）。与之前几项技术类似的是，这项技术也需要提供双链断裂修复的模板，这个修复模板可以是含有突变的原基因，或是含有一个新基因的DNA模板，在细胞依赖自身的能力来进行修复时便可以将期望的序列复制到基因组中。这项技术的先进性在于，可以通过更换特异的向导RNA来重新定义切割特异性；而这种特异的向导RNA相对特异的蛋白来说易于合成，过程也比较短。而且，这项技术比之前的技术都更为精确，即便向导RNA和基因组序列之间仅有一个碱基的差异，Cas9也不会被激活。这个系统原本是从细菌中发现的，细菌用这种机制来防御病毒，细菌一旦探测到与向导RNA匹配的DNA，就能够识别和剪断病毒DNA，实际上可以算作是细菌的一种“获得性”免疫能力，这种能力可以使细菌利用病毒或自身基因组制造出的RNA去精确地清除入侵者。这种方法是不是很眼熟？这跟真核生物中的RNA干扰是非常相似的，所不同的是需要的核酸酶组分比较简单，而且它直接影响DNA序列而不仅仅是抑制蛋白质翻译或引起mRNA的降解。
图3CRISPR/Cas9系统识别并切割DNA双链示意图
这么拼是为什么——展望
梅奥医学中心（MayoClinic）的斯蒂芬·埃克（StephenEkker）形容锌指核酸酶就像是真空管，已经可以在技术层面实现所需要的任何切割，但是步骤多而复杂，所以在很多场景中仅处于原理上行得通但实际上比较难以利用的情形；而TALEN就像是晶体管，它站在锌指核酸酶的“肩膀”上让基因组编辑变得更为容易，但“晶体管”也会遭遇它不可跨越的技术极限，终于CRISPR/Cas9应运而生，带来了更为巨大的革新。
新一代CRISPR/Cas9技术的问世已经引起了越来越多科学家的北京专治白癜风的正规医院北京中科医院曝光
