研究背景

超过90%的JMML患者存在PTPN11、KRAS、NRAS、CBL或NF1的典型突变，这些突变可组成性地激活RAS信号。大约35-40%的JMML患者检测到PTPN11体细胞突变，KRAS和NRAS体细胞突变各约15%，CBL或NF1突变分别约15%和10%。核型异常约35%（最常见的是单倍体7，发生在25%的儿童JMML患者）。全外显子组或靶向测序研究在一些JMML患者中发现了重现性继发性突变，常见的有JAK3、SETBP1和SH2B3。目前，虽然对JMML的诊断主要是基于RAS信号通路的异常激活，但JMML的临床表现存在高度异质性。具有相同突变的患者，在异基因造血干细胞移植后，可能经历疾病的自发缓解或复发，这表明基因型并不总是JMML表型的唯一决定因素。

为了解决这一显著的临床和生物学异质性的问题，最近，三个独立的研究小组基于全基因组DNA甲基化分析描述了JMML的DNA甲基化分组。来自欧洲和美国的研究小组确定了三个具有不同临床特征的JMML亚组，而日本小组建议将其分为高甲基化和低甲基化2个亚组。在这三项研究中，高甲基化亚组与PTPN11突变和较短的总生存率有关。总之，这些研究表明，DNA甲基化作为一种生物标志物，可能有助于改善JMML患者的分层。然而，目前还缺乏通过DNA甲基化鉴定JMML亚类的标准化方法。

结合三个JMML研究小组公布的数据，本研究分析了迄今为止最大规模的JMML患者队列研究中的遗传和DNA甲基化模式。在本研究中，作者试图制定JMMLDNA甲基化分组的国际共识，并系统地描述与每个亚组相关的生物学和临床特征。此外，还开发和验证了适合临床实施的分类方法，并允许在临床试验中进行风险分层。

研究背景

meta分析队列中的患者特征

基于三个研究小组先前发表的研究结果，选择例JMML(n=)和努南综合征以及骨髓增生性疾病患者(NS/MPD;n=29)的DNA甲基化数据进行综合分析。例患者(例来自欧洲，例来自日本，37例来自美国)通过了本次研究的质量控制标准，其中，例(90%)患者被诊断为JMML,29例(10%)患者被诊断为NS/MPD。NS/MPD患者明显比JMML患者年轻，诊断时的中位年龄为0.1岁，所有患儿均在2岁前确诊。

对于JMML患者，DNA甲基组分析的标本来源是骨髓(69%，n=)或外周血(31%，n=80），诊断JMML的中位年龄为1.4岁(40%≥2岁)。69%的患者为男性，31%为女性。例(82%)患者诊断时可检测到HbF水平，/例(69%)患者的HbF水平随年龄升高。诊断时白细胞和血小板计数中位数分别为29.9×/L和65.5×/L。90%的JMML患者检测到典型的JMML驱动基因突变(38%的PTPN11，16%的NRAS，14%的KRAS，14%的CBL和9%的NF1；8%阴性，1%NA)，14%的患者检测到单倍体7。

一致性聚类证实了JMML的三个DNA甲基化亚组

基于已经发表的数据，选择个差异最大CpG位点进行Unsupervisedhierarchicalconsensus聚类，确定了三个不同的DNA甲基化亚群，根据beta值，可分为低DNA甲基化(LM)、中间DNA甲基化(IM)和高DNA甲基化(HM)(图1)。将本次的聚类方法与三个小组的进行比较，甲基化分组的一致性达到91%-96%。

图1DNA甲基化模式确定三个生物学上不同的JMML亚组

图2DNA甲基化亚群中JMML驱动突变的富集

一致性DNA甲基化亚组预测预后并鉴定高危患者

接下来，研究人员分析了DNA甲基化亚组对预后的影响。由于治疗方案和随访时间的差异，对每个研究小组的临床结果分别进行分析。总体生存率的Kaplan-Meier曲线显示，与LM亚组相比，HM亚组的JMML患者在所有研究小组中5年总体生存率均较低(欧洲：62%；日本：46%；美国：42%)。没有造血干细胞移植的JMML患者的长期生存(5年TFS)仅在LM亚组中观察到(欧洲：24%；日本：39%；美国：54%)。

DNA甲基化亚组分类模型的开发

为了前瞻性地将单个JMML患者划分到聚类的DNA甲基化亚组中，研究人员开发并验证了一个甲基化分组模型。测试结果显示该模型预测测试队列中聚类的DNA甲基化亚群的准确性为98%(图3A-3C)。

基于亚硫酸氢盐测序(targetedMethylSeq)的靶向DNA甲基化检测方法，可纳入常规的临床工作流程，用于突变检测。本测试包含个CpG位点，通过质量控制过滤后,个位点可用于分层聚类分析。其中个CpG位点与JMML甲基化分类模型中的个CpG位点重叠，它们的DNA甲基化模式与EPIC阵列数据和k阵列联合队列分析相似(图3D)。

图3JMMLDNA甲基化分类模型的开发

在一个独立的患者队列中验证JMMLDNA甲基化分类模型

为了验证DNA甲基化分类方法，我们对包含47例患者的队列使用靶向深度测序分析，对已知的JMML突变进行了检测。使用EPIC阵列和靶向MethylSeq平台进行DNA甲基化分析。在本队列中，46例患者诊断为JMML,1例诊断为NS/MPD。诊断时的中位年龄为1.7岁，77.8%的患者HbF水平随年龄增长而升高，中位白细胞和血小板计数分别为30.2×/L和67×/L，中位总生存期为6.7年。96%的JMML患者检测到典型的JMML驱动基因突变(PTPN11占44%，KRAS占15%，NRAS占24%，CBL占4%，NF1占9%)，4%的患者为阴性。基于CpGXGBoost分类模型(图4A)以及用于聚类验证的个CpGs位点的最小距离，对单个JMML患者的DNA甲基化水平进行分组分析(图4B)。在CpGXGBoost分类模型中，HM有21例、IM10例、LM16例(图4A)。在HMJMML患者中，PTPN11突变、年龄增高伴随HbF水平显著增加。根据甲基化测序数据对独立队列患者进行分类时，20例HM,8例IM,19例LM。重要的是，HM预测的一致性为95%(图4B)。值得注意的是，对典型JMML驱动基因突变的等位基因频率评估表明，DNA甲基化亚群不会被肿瘤细胞纯度的差异所混淆。既往研究表明，HMJMML主要富集继发性突变。在验证队列中，71%的HM患者和50%的IM患者出现了继发性突变，但没有一例LM患者出现复发的继发性突变(图4C)。有趣的是，在PTPN11突变的JMML患者中，大多数继发突变为JAK3和NF1(79%；11/14);而NRAS突变型JMML患者中最常见的继发突变是SETBP1(%；3/3)。综上所述，我们发现在HM亚群中发现了大量的二次打击。

CpGXGBoostDNA甲基化分类模型的临床相关性跟预后有关，与IM和LM患者相比，HMJMML患者2.5年的总生存期(OS)显著降低(HM：36%；IM：79%；LM：88%)（图4D)。同样，通过靶向甲基化试验确定的DNA甲基化亚组也与预后相关(2.5年OS，HM：45%；IM：63%；LM：84%)(图4E)。

图4DNA甲基化分类模型在独立患者队列中的验证

甲基化水平可独立预测预后

在单变量分析中，OS具有统计学意义的标准如下：诊断年龄12个月(HR=2.75,95%CI=1.08-7.01,p=0.03),血小板≤50(HR=0.35,CI=0.14-0.89,p=0.)和DNA甲基化亚组的p值(XGBoostp=0.0，MethylSeqp=0.)。当使用年龄、血小板和DNA甲基化组的多变量模型时，DNA甲基化分组对OS仍有统计学意义(XGBoostp=0.,MethylSeqp=0.；而年龄(XGBoostp=0.51,MethylSeqp=0.82)和血小板(XGBoostp=0.13,MethylSeqp=0.16)均不显著(表1)。

表一验证队列中总生存率的单变量和多变量分析

研究结果

综上，目前对例JMML患者的meta分析提供了JMML中DNA甲基化亚群的一致性定义。研究人员开发了一个DNA甲基化分类模型，并在一个独立的患者队列中验证了它的准确性。这个分类模型允许对新诊断的JMML患者进行DNA甲基化亚组的前瞻性鉴定，这项工作将支持在临床试验背景下的患者分层和风险适应治疗策略的开发。

参考文献

1，InternationalconsensusdefinitionofDNAmethylationsubgroupsinjuvenilemyelomonocyticleukemia，ClinCancerRes，Jan1;27(1):-.

2，RAS-pathwaymutationpatternsdefifineepigeneticsubclassesinjuvenilemyelomonocyticleukemia,NatCommun,,19;8(1):.

END

编撰

张会军

审核

姚正雄吴春雪排版

汪洁

让诊断触手可及

医检随行

您身边的儿童血液肿瘤诊断助手

长按识别

转载请注明：http://www.jvwih.com/fyys/11190.html